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Pico com ombro inexplicável. Pico dividido. Resolução ruim entre compostos que deveriam estar bem separados. Você revê a coluna, o detector, a fase móvel, o sistema de bombeamento, e nada explica.

Mas, e se o problema estiver no solvente em que a amostra foi diluída?

A amostra deve ser dissolvida preferencialmente na fase móvel, ou em um solvente mais fraco. Caso contrário, efeitos como distorção de pico, perda de resolução e má eficiência são praticamente inevitáveis.

Sim, você pode estar sabotando sua própria análise, mesmo com tudo validado e calibrado, se não observar esse simples (e por vezes ignorado) detalhe.

Por que isso acontece?

A explicação está na física da cromatografia. Quando você injeta uma amostra diluída em um solvente mais forte que a fase móvel inicial (por exemplo, acetonitrila pura, enquanto o início do gradiente é 5% ACN), o analito sai “correndo” da cabeça da coluna antes de ser adequadamente retido.

Resultado?

• Picos achatados, com ombro ou cauda;
• Pico dividido (peak splitting);
• Baixa reprodutibilidade;
• Perda de seletividade;
• E às vezes, a falsa impressão de que a coluna está com defeito.

E o mais preocupante: isso pode acontecer até mesmo em análises de compostos simples, apenas por erro no preparo da amostra.

O ideal é sempre diluir a amostra:

• Na própria fase móvel inicial;
• Ou em um solvente de menor força eluotrópica (por exemplo, mais aquoso que o início do gradiente).

Se não for possível, por questões de solubilidade ou estabilidade, sugere-se reduzir o volume de injeção para minimizar os efeitos: injeções de 2 a 5 µL, no máximo, quando se usa solventes fortes como diluente.

Diagnóstico: quando desconfiar do solvente?

Fique atento a esses sintomas:

• Pico principal com frente larga ou bifurcado;
• Pico pequeno bem na frente do principal (split);
• Repetibilidade aceitável para o tempo de retenção, mas com alta variabilidade de área;
• Mudança de perfil de pico sem mudança no sistema.

Se você vê isso com frequência, é hora de revisar a preparação das suas amostras.

A escolha do solvente da amostra pode parecer trivial. Mas é exatamente nesses pontos “invisíveis” que se revelam os profissionais atentos, que conhecem o sistema como um todo, do frasco ao detector.

Em vários casos, muitos problemas atribuídos à coluna ou ao sistema têm, na verdade, origem na amostra.

E o mais interessante: essa é uma das correções mais rápidas, baratas e eficientes que você pode fazer em HPLC. Basta mudar o solvente de diluição e ajustar o volume.

Você já enfrentou splitting de pico ou resultados inconsistentes que depois descobriu que vinham do solvente da amostra?